碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞的表型变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.020

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (23): 3727-3721.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.020

• 干细胞因子及调控因子 stem cell factors and regulatory factors • 上一篇下一篇

碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞的表型变化

蔡弢艺¹，陈雄生²，贾连顺²，孙延卿¹，林斌¹，陈长青²

¹解放军第175医院骨科医院，福建省漳州市 363000；²解放军第二军医大学附属长征医院骨科，上海市 200003

修回日期:2014-03-12 出版日期:2014-06-04 发布日期:2014-06-04
通讯作者: 陈雄生，博士，教授，解放军第二军医大学附属长征医院骨科，上海市 200003
作者简介:蔡弢艺，男，1980年生，福建省漳州市人，汉族，2012年解放军第二军医大学毕业，硕士，主要从事脊柱外科的研究。
基金资助:
国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2008AA02Z418)

Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells transfected with recombinant adenovirus vectors carrying basic fibroblast growth factor: variation of cell phenotypes

Cai Tao-yi¹, Chen Xiong-sheng², Jia Lian-shun², Sun Yan-qing¹, Lin Bin¹, Chen Chang-qing²

¹Orthopedics Hospital, the 175^th Hospital of Chinese PLA, Zhangzhou 363000, Fujian Province, China; ²Department of Orthopedics, Changzheng Hospital of Second Military Medical University, Shanghai 200003, China

Revised:2014-03-12 Online:2014-06-04 Published:2014-06-04
Contact: Chen Xiong-sheng, M.D., Professor, Department of Orthopedics, Changzheng Hospital of Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
About author:Cai Tao-yi, Master, Orthopedics Hospital, the 175th Hospital of Chinese PLA, Zhangzhou 363000, Fujian Province, China
Supported by:
the National High-Technology Research and Development Plan of China (863 Program), No. 2008AA02Z418

摘要/Abstract

摘要：

背景：外源性碱性成纤维细胞生长因子在韧带组织的愈合过程中发挥着重要作用，采用转基因方法将外源性基因转入细胞内能促进碱性成纤维细胞生长因子分泌。

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞后表型变化及碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。

方法：取P2代骨髓间充质干细胞，分为3组，正常培养组为对照组，其他2组分别转染重组腺病毒(Ad.bFGF-eGFP)及空病毒(Ad.eGFP)。相差显微镜观察各组细胞形态变化，MTT法测定细胞增殖曲线，ELISA法分析各组细胞上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白质量浓度。

结果与结论：转染后细胞呈现均一的成纤维细胞表型；碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒组细胞增殖活性高于空病毒组及对照组；ELISA结果提示碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒组在7 d内上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白质量浓度较空病毒组及对照组增加，差异有显著性意义(P < 0.05)。提示碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染骨髓间充质干细胞可促进其向成纤维细胞分化，增加增殖活力，促进其碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 碱性成纤维细胞生长因子, 骨髓间充质干细胞, 成纤维细胞, 腺病毒, 转染, 863项目

Abstract:

BACKGROUND: Exogenous basic fibroblast growth factor (bFGF) plays an important role in the ligament tissue healing process, and the use of transgenic methods to transfect exogenous genes into cells can promote the secretion of bFGF.

OBJECTIVE: To observe phenotypic changes and the bFGF protein expression after bFGF recombinant adenovirus was used to transfect rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs).

METHODS: Passage 2 BMSCs were divided into three groups: Ad.bFGF-eGFP group, Ad.eGFP group and control group. Under a phase contrast microscope we observed the changes in cell morphology. The expression of bFGF protein in BMSCs was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The proliferative curve was detected by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT).
RESULTS AND CONCLUSION: The transfected cells showed a uniform phenotype of fibroblasts. MTT colorimetric assay revealed that more proliferative activity of transfected BMSCs was shown in the Ad.bFGF-eGFP group than in the Ad.eGFP group and control group. ELISA results showed that expression of bFGF protein was higher in the Ad.bFGF-eGFP group than in the Ad.eGFP group and control group (P < 0.05). BFGF recombinant adenovirus can induce the differentiation of BMSCs into fibroblasts, increase proliferative ability and promote the expression of bFGF protein.

全文链接：

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, fibroblast growth factors, enzyme-linked immunosorbent assay, transfection

中图分类号:

R394.2

蔡弢艺，陈雄生，贾连顺，孙延卿，林斌，陈长青. 碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞的表型变化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(23): 3727-3721.

Cai Tao-yi, Chen Xiong-sheng, Jia Lian-shun, Sun Yan-qing, Lin Bin, Chen Chang-qing. Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells transfected with recombinant adenovirus vectors carrying basic fibroblast growth factor: variation of cell phenotypes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(23): 3727-3721.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养、转染 密度梯度离心法和贴壁法相结合，采用Fercoll分离液进行梯度离心，取中间云絮状一层为单个核细胞分离骨髓液10 mL，培养24 h后开始有圆形细胞沉降贴壁(图1A)，24 h换液细胞可滤去较大血细胞。

观察3 d后开始有梭形细胞贴壁，细胞呈成纤维样外观，散在生长，并有小集落出现，以后细胞呈克隆样生长(图1B)；7-9 d后细胞集落逐渐增大，原代培养约2周时间细胞融合率达到90%，开始传代。细胞贴壁初期呈圆形生长，后呈三角形、多角形和梭形，随后部分区域形成细胞集落，细胞逐渐开始出现纤维细胞梭形外观，有较多突起，胞核明显，卵圆形，可见1-3个核仁，胞质丰富、清晰，生长期细胞分裂相多见，细胞突起互相连接。

P2代骨髓间充质干细胞采用重组腺病毒(Ad.bFGF- eGFP)进行转染，MOI值=50时转染后有较强的绿色荧光表达(图1C，D)，观察后细胞未出现病态现象，生长良好。转染24 h后流式细胞仪显示转染率可达97.8%(图2)，观察14 d后绿色荧光在细胞内仍有连续表达。

2.2 细胞转染后表型、增殖速率及碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达 P2代细胞进行转染后连续培养2周，每日观察细胞表型无明显变化，仍表现为特有的三角形或梭形。MTT法显示重组腺病毒Ad.bFGF-eGFP组细胞增殖速率明显优于空病毒组及对照组(图3)，而空病毒组及对照组间差异无显著性意义。分别收集第2，4，7，10，14天上清液进行ELISA检测，结果发现重组腺病毒Ad.bFGF-eGFP组在7 d内上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达较空病毒组及对照组增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4，5。

参考文献

[1] Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 1997;276(5309):71-74.
[2] Colter DC, Class XR, DiGirolamo CM, et al. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow.Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97: 3213-3218.
[3] Petrigliano FA, English CS, Barba D, et al. The effects of local bFGF release and uniaxial strain on cellular adaptation and gene expression in a 3D environment: implications for ligament tissue engineering.Tissue Eng. 2007; 13(11): 2721-2731.
[4] Sahoo S, Ang LT, Goh JCH, et al. Growth factor delivery through electrospun nanofibers in scaffolds for tissue engineering applications. J Biomed Mater. 2010;93(4): 1539-1550.
[5] 兰秀夫.兔跟腱损伤愈合过程中bFGFmRNA表达的实验研究[J].实用手外科杂志,2003,17(3):159-160.
[6] Hankemeier S, Keus M, Zeichen J, et al. Modulation of proliferation and differentiation of human bone marrow stromal cells by fibroblast growth factor 2: potential implications for tissue engineering of tendons and ligaments. Tissue Eng. 2005; 11(1-2): 41-49.
[7] Oryan A, Moshiri A. A long term study on the role of exogenous humanrecombinant basic fibroblast growth factor on thesuperficial digital flexor tendon healing in rabbits. J Musculoskelet Neuronal Interact. 2011; 11(2):185-195.
[8] Ghosh SS, Gopinath P, Ramesh A. Adenoviral vectors: a promising tool for gene therapy. Appl Biochem Biotechnol. 2006;133(1):9-29.
[9] Petrigliano FA, English CS, Barba D, et al. The effects of local bFGF release and uniaxial strain on cellular adaptation and gene expression in a 3D environment: implications for ligament tissue engineering.Tissue Eng. 2007; 13(11): 2721-2731.
[10] MacLean SB, Gratzer PF. Effect of basic fibroblast growth factor on the cellular repopulation of decellularized anterior cruciate ligament allografts. J Tissue Eng Regen Med. 2011; 5(3):201-209.

引言

骨髓间充质干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞^[1]。骨髓间充质干细胞可以通过骨髓穿刺获得，体外易于分离、纯化、培养、扩增^[2]，在体外培养扩增3周可获取2×10⁷个细胞，是组织工程良好的种子细胞来源。相关生长因子可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化，不同的细胞因子对骨髓间充质干细胞的功能亦有影响。

碱性成纤维细胞生长因子是重要的有丝分裂促进分子，韧带组织愈合过程中碱性成纤维细胞生长因子对于中胚层及神经外胚层来源的细胞都有强烈的促有丝分裂作用，能有效的促进细胞增殖，自我更新，研究表明其可诱导间充质干细胞向韧带细胞方向分化^[3-4]。肌腱愈合的自然过程中碱性成纤维细胞生长因子的mRNA表达出现于损伤后第1天，于第7天出现高峰，并在随后的2周内下降到较低的水平^[5]，在韧带修复过程外膜碱性成纤维细胞生长因子蛋白的高分泌对于韧带早期修复具有促进作用，在损伤韧带的重塑形及提高新生韧带的生物力学强度上也有着重要作用。外源性碱性成纤维细胞生长因子对细胞增殖促进作用有明显的量效关系，Hankemeier等^[6]发现低剂量碱性成纤维细胞生长因子(3 μg/L)添加于培养基中能使骨髓间充质干细胞增加Ⅰ，Ⅲ型胶原、平滑肌肌动蛋白、波形蛋白和纤维粘连蛋白mRNA的表达，其均为韧带的特异性细胞外基质。

在新西兰兔浅屈肌腱修复过程中外源性碱性成纤维细胞生长因子通过皮下注射能减少局部的瘢痕形成并增加肌腱的净质量及生物力学强度，其主要通过促进肌腱细胞成熟及增强胶原纤维直径与密度实现^[7]。

实验以腺病毒载体携带碱性成纤维细胞生长因子基因(Ad.bFGF-eGFP)转染骨髓间充质干细胞，观察转染后细胞形态、增殖速率及碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达水平的变化，探讨转基因骨髓间充质干细胞作为组织工程韧带种子细胞的可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：对比观察实验。

材料：

实验动物：新西兰大白兔，3月龄，体质量1.0-1.5 kg，由解放军第二军医大学实验动物中心提供。

实验过程中对动物的处置应符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

方法：

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养方法：在无菌条件下采用髂前上棘穿刺获取兔骨髓2.0-3.0 mL，密度梯度离心及贴壁法采集骨髓间充质干细胞，细胞计数。以 1×10⁸ L^-¹ (T-25 cm培养瓶)的细胞浓度接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂的饱和度湿度培养箱中，培养3 d后，全量更换培养基，弃掉未贴壁细胞。

在培养过程中，每3 d全量换液1次。当原代细胞(P0)生长至瓶底部80%-90%融合时用1∶1的EDTA(2%)和胰蛋白酶(25%)混合液消化传代，在倒置显微镜下观察控制消化时间，以5×10⁷ L^-¹的浓度接种于T-25cm培养瓶中进行扩增培养。

腺病毒转染：24孔板标记顺序后分成3组，每组接种P2代骨髓间充质干细胞1×10⁴个，培养24 h。第1，2孔用Ad.bFGF-eGFP病毒液浸染，作为第3，4孔用Ad.eGFP病毒液浸染，前2组MOI值设为50，第5，6孔继续常规培养。37 ℃体积分数5%CO₂孵育箱中孵育24 h后换用体积分数10%胎牛血清DMEM培养液。每72 h收集一次培养的上清液，装入15 mL离心管，共收集5次，每次收集后向细胞中重新加入体积分数10%胎牛血清DMEM培养液。转染后采用流式细胞检测细胞绿色荧光表达

MTT法检测细胞增殖速率：Ad.bFGF-eGFP转染骨髓间充质干细胞后，与正常第2代骨髓间充质干细胞以1×10³/孔的浓度分别接种于96孔培养板，每个培养板每组接种8孔，培养后3 d后在各检测孔吸去培养液，PBS冲洗3遍后加入MTT 100 µL，37 ℃孵育4 h，加DMSO 100 µL，30 min待结晶完全溶解后，以MTT 100 µL+ DMSO 100 µL做标准孔，紫外分光光度计450 nm检测吸光度值(A)。

ELISA法检测上清液碱性成纤维细胞生长因子蛋白含量：将抗原用包被稀释液稀释到每孔20-200 μg，每孔抗原加入100 μL，置37 ℃，4 h，弃去孔中液体。体积分数5%胎牛血清置37 ℃封闭40 min。封闭时将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中的气泡，封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3 min。洗涤方法：吸干孔内反应液,将洗涤液注满板孔，放置2 min略作摇动，吸干孔内液，倾去液体后在吸水纸上拍干，洗涤次数3次。

根据酶结合物提供商提供的参考工作稀释度进行。37 ℃，30 min，每孔加100 μL，洗涤同前。每孔加入底物液(TMB-过氧化氢尿素溶液)100 μL，置37 ℃避光放置3-5 min，加入终止液显色。每孔加入终止液50 μL终止反应，于20 min内测定实验结果。

主要观察指标：相差显微镜观察各组细胞形态变化，MTT法测定细胞增殖曲线，ELISA法分析各组细胞上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白含量。

统计学分析：由本文作者进行统计学处理，3组间差异应用单因素方差分析，组间两两差异比较应用LSD-t 检验， P≤ 0.05为差异有显著性意义，所有数据的差异分析应用SPSS 16.0软件处理。

全文链接：

讨论

骨髓中骨髓间充质干细胞的含量约1/10⁵，穿刺得到的骨髓间充质干细胞远不能满足组织工程种子细胞的要求，骨髓间充质干细胞自我复制能力强大，且可以经过不可逆的终末分化过程产生子代细胞。通过密度梯度离心法和贴壁法相结合6周后可获得10⁹倍细胞，连续传代的细胞增殖及分化能力较原代细胞无明显差别。目前骨髓间充质干细胞的鉴定尚无统一方法，采用多重方法进行细胞鉴定，包括：①根据细胞形态观察和培养特性检测。观察体外培养的骨髓间充质干细胞体积小，呈梭形，核浆比大，能连续传代培养且细胞形态不发生较大变化。②根据表面标记分子检测，骨髓间充质干细胞不表达分化相关的细胞标志，如碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅲ型胶原和骨桥蛋白；也不表达造胞系的表面标志，如CD34、CD45、vW因子和HLA-DR等；但表达CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白。③根据细胞多向分化的潜能进行鉴别。在特定条件下骨髓间充质干细胞可分化为软骨细胞、脂肪细胞、骨细胞、肝细胞、神经细胞等。骨髓穿刺后采用密度梯度离心法和贴壁法相结合在培养过程中能逐渐纯化和分离出骨髓间充质干细胞，并通过连续培养达到组织工程种子细胞的需要量。

生长因子在肌腱愈合过程中运用转基因是将外源目的基因通过载体转移到靶细胞内以补偿靶细胞的基因缺陷，调节靶细胞蛋白质的分泌水平，使其获得新的生物学行为和功能，目前已广泛运用于细胞的基因改造，外源基因的导入方法很多，主要包括生物学载体法，机械法，化学法。腺病毒载体作为生物载体的一种，具有以下特点^[8]：①宿主范围较广，转染后致病性低。②稳定性良好，感染效率高，对于增殖相及非增殖相的细胞均有较高的感染能力。③目前基因不整合到染色体中，能插入相对大段的目的基因，且病毒基因不随着细胞的传代而传代，插入突变的发现率低。④能较方便的在同一株细胞或组织中设计多个基因的表达系统。生长因子及其受体在肌腱愈合过程中起着重要的调节作用，目前运用的生长因子种类繁多，碱性成纤维生长因子在韧带组织愈合过程中对中胚层及神经外胚层来源的细胞都有强烈的促有丝分裂作用，能促进细胞增殖，分裂，自我更新，研究表明其可诱导间充质干细胞向韧带细胞方向分化。内源性碱性成纤维生长因子在肌腱损伤愈合过程中分泌活跃，并以旁分泌的方式介导邻近腱细胞的愈合，随着修复周期的完成，分泌量逐渐降低^[9]。外源性的碱性成纤维生长因子具有同样的生物学效能，MacLean等^[10]发现6 μg/L是碱性成纤维细胞生长因子促进前交叉韧带纤维母细胞的增殖的最佳浓度，其可能通过调节细胞分解代谢通路来产生作用，增加或减低浓度都将对其效果产生影响。

本次实验采用腺病毒载体携带碱性成纤维细胞生长因子基因与绿色荧光病毒进行细胞转染，采用不同的MOI值进行转染，结果发现MOI值为50时进行转染效率最高，细胞毒性小。转染后细胞增殖活跃，上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达水平在1周内较空病毒组及对照组明显升高，随着传代次数的增多，蛋白表达水平与空病毒组及对照组细胞差异性逐渐减小，此过程符合肌腱愈合的自然过程。

该实验为转基因骨髓间充质干细胞作为组织工程肌腱的种子细胞提供了实验基础。目前实验尽在于细胞水平，碱性成纤维生长因子分泌量的增加，在体内会不同程度加重肌腱粘连的发生，其在体内的安全性及最后能否提高腱骨愈合水平还有待后续实验的证明。

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.

碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞的表型变化

Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells transfected with recombinant adenovirus vectors carrying basic fibroblast growth factor: variation of cell phenotypes

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价